荧光显微镜的使用方法

显微镜操作指南：从准备到观察

一、准备工作：

1.环境控制：为了确保观察效果，白天请使用窗帘遮蔽外界光线，夜间则关闭所有室内照明。

2.仪器检查：确认汞灯或光源稳固安装，物镜转换器处于待用状态，滤光片组位置正确无误。同时检查仪器各部分是否完好无损，确保一切正常后再进行操作。

3.开机预热：开启主机电源后，对于汞灯需要预热至少15-30分钟以确保其性能稳定。卤素灯则在观察明场时单独开启。

二、样本放置：

将样本放置在载玻片上，注意盖玻片应朝下放置（对于倒置机型），或者按照使用说明进行常规放置（正置机型）。使用载物台夹具固定样本，确保观察区域准确无误地位于光路中心。

三、光路调节：

1.明场观察：切换聚光镜至明场模式（BF或PHA），并根据需要调节孔径光阑至物镜数值孔径的70%。

2.荧光观察：选择对应的荧光通道如DAPI、FITC或TRITC。确保激发块与样本的荧光标记相匹配，如使用FITC时需选择蓝色激发滤光片。同时调节汞灯位置，确保光斑均匀。

四、对焦观察：

首先使用低倍物镜（如4X或10X）大致调整样本至轮廓清晰。然后转至高倍物镜（如40X或60X）进行精细对焦。正置机型需顺时针旋转粗调以避免压碎玻片，而倒置机型则通过Z轴微调旋钮进行精确对焦。

五、图像采集：

完成光路调节和聚焦后，进行图像采集。切换光路至相机端口，并调整曝光时间（通常在100ms至2s之间）以避免过曝。进行白平衡校正时，需选择空白区域作为参照。当进行多通道拍摄时，按照DAPI→FITC→TRITC的顺序进行采集，以避免荧光串扰。

六、关机程序：

操作结束后，需按照正确的关机程序进行操作。首先关闭汞灯电源并等待其冷却至少30分钟后再关闭主机。然后将物镜转至低倍位置，聚光镜降至最低点。最后用防尘罩覆盖机身以保护显微镜，并记录汞灯的累计使用时间。

注意事项：

1. 汞灯寿命约为200-300小时，达到寿命后需及时更换。

2. 对于多色荧光观察，建议使用8位荧光模块以减少滤光片的更换。

3. 观察活细胞时，推荐使用40倍的硅油物镜，以保持培养液的折射率。

4. 操作全程需佩戴防UV护目镜，以保护眼睛免受紫外线伤害。

以上操作指南旨在为您提供一个清晰、系统的显微镜操作流程，确保您能够准确、高效地完成显微镜操作任务。